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Western blot的內(nèi)參該如何選擇

更新時(shí)間:2024-04-26點(diǎn)擊次數(shù):673
  內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins),它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來(lái)做參照物。那么你知道Western blot的內(nèi)參該如何選擇嗎?讓我們一起來(lái)看看吧!
  為什么要使用內(nèi)參
  Western blot除了能證明某樣品含有某種蛋白之外,其最為重要的作用是比較不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少。即為蛋白表達(dá)水平最直接的證據(jù)。要衡量蛋白的表達(dá)水平,前提條件就是等量的上樣量。然而如果僅將蛋白濃度測(cè)定作為規(guī)范需相互比較的各種樣品間上樣量等同的唯1方法,顯然是不可取的。
  在Western Blot中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參,這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá),由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否完q、整個(gè)Western Blot顯色或者發(fā)光體系是否正常。
  如何選擇內(nèi)參
  一般來(lái)說,我們?cè)龠x擇內(nèi)參時(shí)需要考慮以下幾個(gè)因素:
  1、蛋白表達(dá)豐度:內(nèi)參應(yīng)該在樣本中穩(wěn)定表達(dá),且表達(dá)量相對(duì)較高,這樣才能有效地檢測(cè)到內(nèi)參信號(hào)。
  2、分子量:內(nèi)參的分子量應(yīng)該與目標(biāo)蛋白的分子量有明顯差異,以便在電泳分離時(shí)能夠分開。
  3、細(xì)胞類型和組織特異性:根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)樣本類型,選擇適合的內(nèi)參。例如,β-actin常用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞,而Tubulin則更適合檢測(cè)細(xì)胞骨架蛋白。
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